——前言——
今天早上讲解机制时，自己内心对于某些点还是拿捏不住，趁周末，再查阅下相关资料，不能以其昏昏，使人昭昭。困惑的点还是CTLA-4这个靶点。
伊匹木单抗终于在国内获批上市了，在网络收看了有关其作用机制的讲解，尤其是伊匹木单抗这种一代的抗CTLA-4单抗的广泛作用，总共差不多有5点吧。抗CTLA-4单抗的作用机制不断被挑战，PD-1/CTLA-4双抗机制却不断夯实一文中有过浅显的讲解，本次我们重要再介绍下有关Treg细胞上CTLA-4靶点的作用，我觉得也是目前比较有争议的点。因为，阿斯利康的抗CTLA-4单抗tremelimumab，在联合抗PD-L1单抗Imfinzi，在几项研究中也取得了III期试验的成功，PD-L1/TGFβ双抗落败“小癌王”，度伐利尤单抗成功以及肝癌免疫治疗，PD-L1靶点优于PD-1？抗血管靶向联用的功效？在肝癌和胆管癌这种异质性很强的癌肿上，取得突破是非常难得的。另外，年5月7日，阿斯利康宣布代号为POSEIDON的III期临床研究取得积极结果，该研究评估了阿斯利康抗-PD-L1单抗Imfinzi（度伐利尤单抗）联合含铂化疗或Imfinzi联合抗CTLA4单抗tremelimumab和化疗组成的三联疗法vs.单纯化疗一线治疗IV期(转移性)非小细胞肺癌(NSCLC)患者疗效。
而tremelimumab与伊匹木单抗相比，是不存在Fc段介导的ADCC等效应的，这是对于伊匹木单抗通过结合Treg细胞上的CTLA-4靶点，进而通过ADCC效应杀死在肿瘤微环境中具有免疫抑制作用的Treg细胞的论据，有些被挑战，也让CTLA-4单抗中国价格出炉，生物类似药研发加速，国产化替代可期？一文中提到的一众国产生物类似药处于困境，因为基本采用的都是具有强ADCC效应的结构。所以，有可能Treg细胞上的CTLA-4这个靶点，还具有值得探讨的其他的作用。也是本文的目的。
——Treg的免疫抑制功能——
在开始正文前，首先让我们介绍下Treg细胞。自然发生的Treg(nTreg)与传统的T细胞(Tcon)有着相同的发育路径，从骨髓进入胸腺，在那里进行传承。nTreg可以识别自身抗原，但不会进行阴性选择。相反，它们上调FoxP3，形成一个抑制性T细胞群，保护淋巴管和组织免受过度免疫反应。然而，当CD4+初始T细胞在外周遇到TGF-β（转化生长因子β）和IL-2存在的抑制性环境时，其被激活成为诱导Treg(iTreg)。iTreg在体外也可以通TGF-β和IL-2对TCR刺激而形成，这使它们成为临床上抑制不必要的免疫反应的实用工具。此外，Treg可以根据它们的位置和稳定信号需求分为两个亚型，中央和效应Treg。
而且，除了经典的CD4+Treg，还有CD8+的对应物，它被证明参与了GvHD的免疫调节，其被定义为Treg的几个亚群，如Tr1或Th3细胞。最近的研究表明，免疫反应的最初偏好形成了发育中的Treg，这些Treg具有适当的特征，如归巢受体，以抑制Th1-、Th2-或Th17特异性免疫反应。然而，最近的一项研究表明，这种特征并不代表一个稳定的系别存在，而是一个动态的过程，以维持内环境稳定。
为了发挥其抑制过度免疫反应或辅助消除感染后的收敛阶段的功能，Treg必须能够进入包括淋巴组织和非淋巴组织在内的各种组织。高功能Treg拥有CD62L的属性表达，CD62L是一种淋巴结归巢分子，能够使他们到达二级淋巴器官，在那里引发T细胞反应。组织特异性归巢受体（这一点很重要，解决了我一些疑惑），如C-C趋化因子受体5型(CCR5)CCR8或CCR9，由于它们对炎性位点的特异性引导其进入靶器官，该处炎性反应需要抑制，并在激活过程中印记在Treg上。有关Treg的免疫抑制作用，机制是非常复杂的。主要概括为以下三点。
在多层次的免疫反应中Treg细胞发挥抑制作用
(1)APC的成熟和抗原提呈：Treg能破坏固有免疫细胞的成熟、迁移和效应功能。此外，它们还诱导B细胞和中性粒细胞凋亡。Treg通过CTLA-4结合降低DCs的共刺激活性，破坏效应T细胞与DCs的接触。
(2)效应T细胞的抑制：通过清除IL-2抑制增殖。此外，它们通过诱导细胞因子被剥夺的环境限制细胞因子的产生和存活，并减少归巢受体的表达，从而导致效应细胞迁移受损。
(3)对局部炎症组织的影响：Treg分泌多种抗炎性细胞因子，包括TGF-β、IL-10和IL-35，可以抑制炎症。
——Treg与CTLA-4——
总体而言，Treg会抑制T细胞反应，CTLA-4这个靶点在Terg的免疫抑制作用上是起了很重要的作用的，在肿瘤免疫循环七步图中，CTLA-4作用于第三步，负性调控T细胞的激活和动员。主要发挥作用的机制有两条：
与T细胞上的CD28竞争性地与APC上的CD80、CD86结合，从而抑制T细胞的激活。这个论点的证据在于CTLA-4与CD80、CD86的亲和力更高。
另外就是通过CTLA-4介导Treg对APC细胞表面CD80，CD86进行反式内吞，降低APC细胞表面CD80、CD86的表达来减少对T细胞表面CD28的激活。
肿瘤免疫循环七步图
对于第一条作用机制，我是比较了解的，但对于第二条机制，还是搞不懂，究竟是如何将APC细胞表面的CD80，CD86进行反式内吞的，还需要好好查询资料。
年的一篇比较权威的文章有对第二条机制进行论证。具体操作方式是，首先体外对Treg细胞和传统CD4阳性T细胞（Tconv）的CTLA-4进行定量，包括细胞膜表面的CTLA-4（4℃孵育抗体），可以循环的CTLA-4（37℃孵育抗体），总-CTLA4（固定破膜后孵育抗体）。结果显示Treg细胞表面组成型的表达CTLA-4，并且有大量的CTLA-4在胞内和胞膜之间循环，而Tconv细胞表面CTLA-4需要进行过TCR的刺激之后才能被诱导。
细胞膜表面受体可以循环，换成另一种表述——内化，这个过程被人熟知的例子包括FcRn受体，ADC药物等。那么有理由推测CTLA-4是不是会介导CD80/CD86内化到Treg细胞内？采用CHO-GFP-CD80细胞和Treg细胞进行体外孵育，结果显示6h后在Treg细胞内观察到荧光信号，而Tconv细胞需要在24h后才可以观察到。进一步以溶酶体抑制剂BafA作用Treg细胞，表面CTLA-4可能介导了CD80在Treg细胞内的降解。
Treg上的CTLA-4循环
为了进一步确证，从WT/CTLA4KO小鼠的嵌合骨髓中分离Treg细胞，体外和CHO-GFP-CD80细胞进行孵育，结果显示CD80的被内吞过程依赖于CTLA-4，并且只发生在效应Treg细胞上（CTLA4表达更高）。进一步用BMDC-GFP-CD80细胞和OVA-TCR-Treg细胞共孵育，结果显示在OVA存在下会发生梯度浓度的CD80“丢失”，而CTLA-4抗体可以阻断这个过程（这个过程就是BMDC会结合OVA，然后会和含OVA-TCR的Treg结合，这样会激活Treg细胞，从而引发CTLA-4“吃”CD80。下图CTLA4抗体阻断结果显示的比例，而实际阻断的是整体MFI）。接下来，研究者在小鼠身上验证了内吞现象，并且在使用抗CTLA-4单抗后，也发现了相关证据。
整体来说，这篇文章提示了Treg细胞通过CTLA-4介导迁移性DC细胞（包括cDC1和cDC2）表面CD80的反式内吞，抑制T细胞的激活，从而加深了我们对CTLA-4这个靶点以及CTLA-4抗体作用机制的思考。
参考文献：
1.AdvancesandControversiesinHematopoieticTransplantationandCellTherapySeriesEditors：SyedA.AbutalibDeerfield,Illinois,USAandJamesO.ArmitageOmaha,Nebraska,USA.
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