摘要
目的：Ki67是肿瘤增殖活性的标志物，对多种实体恶性肿瘤的预后有重要意义。我们试图探讨非小细胞肺癌患者肿瘤切除术后的Ki67表达、免疫细胞浸润和免疫检查点表达之间的关系。
方式：对-年间行I~III期非小细胞肺癌切除术的患者标本进行组织芯片分析。由表达Ki67的癌细胞百分比来定量增殖指数。对表达于恶性肿瘤细胞(程序性死亡配体1，B7H3，B7H4,吲哚胺2,3-dioxygenase1)和淋巴细胞(t细胞免疫球蛋白和mucin-domaincontaining3，V-domainsuppressorofT-cellactivation,肿瘤坏死因子受体4，淋巴细胞激活基因3,inducibleT-cellco-stimulator)的检查点被基于瘤内和基质内进行独立分析。并在一个有代表性的亚群中，对瘤内和瘤周的免疫细胞密度进行量化。
结果：共有例患者符合纳入标准。Ki67在鳞状细胞癌(恶性细胞阳性率为31.4%，腺癌阳性率为15.2%，P.)，晚期肿瘤(阶段II/III25.7%vs20.8%阶段I,P.)，和低分化肿瘤(28.8%vs15.4%，P.)中呈高表达水平。Ki67水平与瘤内表达的程序性死亡配体1、B7-H3、吲哚胺2,3双加氧酶1，和基质表达的淋巴细胞激活基因3和诱导t细胞共刺激因子水平呈正相关。Ki67表达与CD57+和CD4+细胞的瘤内密度成负相关。在I期肿瘤中，Ki67与检查点表达的相关性最强。在I期患者中，Ki67升高独立地与整体生存率降低相关。
结论：Ki67表达升高与具有生物侵袭性的非小细胞肺癌、免疫检查点表达增强以及瘤内免疫细胞浸润减少有关。这些发现在早期疾病中最为明显，值得在新的治疗药物的背景下进行进一步的研究。(JThoracCardiovascSurg)
观点：Ki67是一种肿瘤增殖活性的生物标志物，已被证明与NSCLC的不良预后有关。通过分析Ki67的肿瘤表达，我们证实了肿瘤增殖的增加与免疫检查点的表达之间的联系。这些发现提示Ki67可作为早期NSCLC免疫抑制微环境的标志物。
免疫检查点阻断在非小细胞肺癌(NSCLC)治疗中的成功应用，使肿瘤与免疫细胞相互作用的重要性凸显出来。越来越多的证据表明，这些治疗方法的开发和应用是合理的，肿瘤的先天性和适应性反应的特征是代谢信号和免疫检查点的表达之间复杂的相互作用导致的，其在局部肿瘤微环境(TME)中具有免疫抑制或免疫激活作用。随着这些新疗法在早期和晚期疾病的治疗中获得更广泛的临床应用，将需要对治疗效果进行预测，因为并非所有患者都会有效。增强对肿瘤细胞和免疫系统之间相互作用的理解可能有助于识别代表疗效的生物标志物。
Ki67是一种核蛋白，在有丝分裂过程中对核糖体RNA的合成和染色质结构的组织与维持，发挥作用。Ki67的致瘤特性已被提出，并作为一个潜在的治疗靶点被进一步探索。虽然它可以在整个细胞周期中被检测到，并且在静止细胞中以低水平的本构性表达，但它的表达在以细胞快速生长为特征的阶段是最高的。在非小细胞肺癌中，肿瘤增殖具有预后意义；最近的一项对项研究的荟萃分析发现，在某些情况下，Ki67的表达与不良的肿瘤学结果之间存在一致的相关性。
尽管Ki67在NSCLC中的表达对预后的意义已被广泛研究，但肿瘤增殖活性与局部免疫微环境特征之间的关系尚不清楚。根据免疫微环境特征、治疗后结果和对免疫检查点抑制反应之间的已知关系，了解Ki67在多大程度上反映了免疫上有利或不利的TME，有助于指导有关治疗选择和时机的决策。此外，鉴于针对肿瘤和免疫细胞上表达的免疫检查点的治疗剂的开发和临床应用正在研究当中，描述目前为止尚不明确的肿瘤增殖活性和免疫抑制特征之间的关系是一个有待探索的临床重点研究方向。我们假设Ki67能量化的肿瘤增殖活性，并反映免疫抑制的微环境，那么反过来，它将与接受手术治疗的非小细胞肺癌患者化疗后的不良生存结果相关。
材料与方法
患者群体
年至年间接受手术且有准确信息的I期至III期的早期NSCLC，并有符合分析条件的病理Ki67表达数据的患者。从前瞻性维护的科室数据库中回顾性查询基线临床病理特征。由于新辅助治疗已被证明与TME的变化有关，接受新辅助化疗或放射治疗的患者被排除在外。肿瘤是使用第七版美国癌症联合委员会分期系统进行分期的。这项回顾性研究是在放弃知情同意的情况下仍由德克萨斯大学MD安德森癌症中心的机构审查委员会批准的。
免疫组织化学染色与图像分析
为了量化Ki67和免疫检查点的表达，使用前述的方法（18），使用福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤块构建组织微阵列。简而言之，使用从肿瘤中心、周边和中部获得的三个1.0mm核心制备组织微阵列切片。使用自动染色系统(Bond-Max，LeicaMicrosystems，加利福尼亚州Vista)。在使用AperioATTurbo系统(徕卡微系统)以x倍进行扫描后，专业训练的病理学家检查了扫描的图像(ImageScope，徕卡微系统)，并使用AperioeSlideManager(徕卡微系统)创建了数字组织微阵列块。以表达Ki67的肿瘤细胞百分比来量化肿瘤的增殖(Ki-67/克隆MIB-1[M]，稀释度1：；加利福尼亚州达科，Carpinteria)。如上所述，在例患者中，例(96.8%)在肿瘤间质中检测到了主要表达于恶性肿瘤细胞上的检查点（[PD-L1],B7-H3,B7-H4,[IDO1]）的细胞百分比，以及宿主肿瘤相关免疫细胞上表达的检查点（T细胞活化的V结构域抑制因子，肿瘤坏死因子受体超家族成员4，[ICOS]，[LAG3]，以及T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3）的细胞密度。对于一个有代表性的肿瘤亚群(，90.0%)，该完整的肿瘤切片以前被用于量化表达分化簇的肿瘤相关免疫细胞群，用以往已采用已发表的方法，在肿瘤内(肿瘤巢和肿瘤间质)和瘤周间隔的5个1mm区域内，使用完整的肿瘤切片来量化表达分化簇（CD3、CD4、CD8、CD57、颗粒酶B(GZB)、CD45RO、程序性细胞死亡蛋白1(PD1)、叉头盒P3(FOXP3)和CD68）的肿瘤相关免疫细胞群。以人扁桃体组织为阳性(抗体染色)和阴性(未染色)对照。分别使用ScanScopeAperioATTurbo扫描仪和ImageScope软件(均为LeicaMicrosystems)，扫描和可视化染色的幻灯片，并使用AperioImageToolbox(LeicaMicrosystems)对成像数据进行可视化和分析。
统计分析
用Spearman等级相关检验分析Ki67表达、免疫检查点和免疫细胞密度之间的关系(范围-1[完全负相关]到+1[完全正相关]，r=0表示没有相关性)。为了控制多重比较，使用错误发现率调整的P值(Q值)来评估由Ki67表达二分法的样本之间所有的成对相关性和标记密度分析。因为基于家庭的错误率方法是保守的，可能导致发现错误，所以我们选择使用错误发现率方法来识别尽可能多的重要关联（在增加I型错误率的限制下），同时控制错误阳性结果的发生率。使用Mann-WhitneyU和Kruskal-Wallis检验评估了两组之间的Ki67表达差异。根据MC中Ki67的表达程度，生成热图以识别免疫检查点的有关共表达和免疫细胞浸润的模式。对于与Ki67有统计意义的成对相关的免疫检查点，通过拟合具有高斯分布和同一性联系的广义线性模型来进一步模拟关联，以说明相关的临床病理特征(年龄、性别、吸烟状况、组织学、分化程度、病理分期；采用Akaike信息标准进行最终模型选择)。总生存期(OS)定义为从手术到死亡的时间；或对于研究结束时还活着的患者记录到最后一次接触之日。无病生存(DFS)被定义为从手术到疾病复发或死亡的时间；没有DFS事件的患者记录到最后一次接触之日。采用单因素Cox比例风险回归分析临床病理参数与Ki67表达和OS的关系。单变量分析中P值小于.20的变量被包括在多变量模型中；然后执行逐步向后剔除，直到最终多变量模型中的所有变量满足P小于.10作为最终选择标准。中位随访时间计算为从手术到最后一次接触或死亡的中位时间。用Kaplan-Meier方法估计存活率，用logrank检验分析各组之间无事件-时间结局的差异。所有的分析都使用SPSS（24.0.0版；IBMArmonk，NY)和R(3.3.0版；