食管鳞癌干细胞标志物
王琳医院老年科
医院肿瘤内三科
我国食管癌以食管鳞状细胞癌（ESCC）为主，-年间发病率居恶性肿瘤第六位，死亡率是第四位，复发和转移、肿瘤耐药是治疗失败及死亡主要原因。愈来愈多研究提示ESCC存在肿瘤干细胞，并与其不良生物学行为及药物耐受密切相关。
恶性肿瘤组织中存在数量极少的具干细胞特征细胞群（不足5%细胞具干细胞特性），即肿瘤干细胞（CSCs），其具有很强的自我更新、无限增殖能力和肿瘤各组分多向分化潜能，同时能促肿瘤形成、发展、转移和复发，且与肿瘤耐药
性密切关联。白血病、乳腺癌、，脑肿瘤、恶性黑色素瘤[9]等均已发现CSCs，或源于组织正常干细胞发生不断累积的致瘤性突变[10]，或源于分化细胞有关基因发生突变，致其重新获得干细胞特征[7]。CSCs标记物是分离鉴定CSCs的特异性标记物，有助于肿瘤诊断、预后判断、靶点筛选和治疗。多种实体瘤中存在CSCs生物标志，如乳腺癌的CD24/CD44、脑胶质瘤的CD等。而ESCC的CSCs生物标志物信息少，尚未发现肿瘤干细胞特异性细胞表面标记。
p75NTR
p75NTR是一种低亲和性神经营养素受体(neurotrophinreceptorp75,p75NTR)，蛋白分子量约75Da，属I型跨膜肿瘤坏死因子超家族成员，与NGF、BDNF、NT-3和NT-4等低亲和性结合，在高亲和力受体Trk存在下被活化，提高对神经营养因子反应性[14]。正常食管上皮p75NTR阳性细胞具增殖、自我更新及多向分化能力，经鉴定为食管上皮干细胞。由于肿瘤干细胞与组织干细胞可能具有相同或相似标记，推测，食管肿瘤干细胞与食管上皮干细胞二者可能有相似表面标记p75NTR。Okumura等免疫组化法检测p75NTR阳性人ESCC细胞分布，证实高、中等分化人ESCC组织p75NTR阳性细胞主要分布在肿瘤侵袭性边缘1～2层，低分化ESCC组织则呈不规则弥散状分布。Huang等[17]采用FACS法，研究多种ESCC细胞株p75NTR阳性细胞存在比例，结果为1.6％-3.7％。孙等[18]应用磁珠分选法(MACS)分选出p75NTR阳性细胞，发现人ESCC中p75NTR阳性细胞具有自我更新、分化、增殖能力，并具有较强的致瘤能力，p75NTR阳性细胞具有CSCs的特性。叶等发现p75NTR阳性ESCC细胞较阴性细胞具有更强的侵袭性、耐化疗药物能力和致瘤能力，即具有CSCs特性；阳性ESCC细胞中可能富集ESCC的CSCs干细胞。
Huang等发现单个p75NTR阳性细胞可在无血清培养基中悬浮生长并形成干细胞球，可连续传代30代以上，其增殖子代细胞既有p75NTR阳性细胞又有p75NTR阴性细胞；而p75NTR阴性细胞只能贴壁生长，其增殖子代细胞全部为p75NTR阴性细胞，说明p75NTR阳性细胞具有自我更新、多向增殖分化的能力。同时p75NTR阳性细胞较p75NTR阴性细胞表现出明显的耐药性；Sun等从原代培养的ESCC细胞中分选出p75NTR阳性细胞，将其移植入免疫缺陷小鼠背部皮下，发现最低个即可成瘤，其肿瘤形成能力大约是p75NTR阴性细胞50倍，即p75NTR阳性细胞较p75NTR阴性细胞具更强成瘤能力。
由于部分ESCC细胞株中p75NTR阳性细胞高达30.1％，远高于CSCs正常比例，推测并非每个p75NTR阳性细胞都是CSCs[17]，而且p75NTR阴性细胞也有一定成瘤能力，Sun等[18]就发现p75NTR阴性细胞在软琼脂中也能形成少部分克隆。部分研究结果未证实p75NTR表达水平与食管癌分级、淋巴结转移等存在联系。因此，p75NTR并非人食管肿瘤干细胞惟一标记，p75NTR作为ESCC干细胞特异性标志还有待深入研究。
Podoplanin
分子质量为38×的podoplanin是I型跨膜糖蛋白，主要表达于淋巴管内皮细胞表面，血管内皮细胞不表达，是淋巴内皮细胞特异性标志物，过度表达能促伸展细胞扩展，提高细胞黏附、迁移功能。
最近发现podoplanin还表达于多种恶性肿瘤细胞表面，98％鳞状细胞癌如肺癌、喉癌、宫颈癌、皮肤癌及食管癌，和中枢神经系统肿瘤及生殖细胞肿瘤中均有表达，一般表达在肿瘤边缘单细胞层上。Tong等发现正常食管上皮组织基底层极低量表达Podoplanin，认为这小部分细胞可能是正常干细胞或者肿瘤起始细胞；而ESCC术后组织podoplanin表达阳性率80%（45/56），高表达率37.5%（21/56）。而Rahadiani等却认为正常食管黏膜上皮不表达podoplanin，食管上皮内瘤样病变组织podoplanin则为阳性，且只表达在癌巢外缘。并发现ESCC组织podoplanin高表达率31.1%（11/61）。袁等发现ESCC组织内淋巴管和肿瘤细胞都有podoplanin表达，主要位于细胞膜。表达呈两种模式：弥散型，表现为肿瘤组织弥漫性表达；集中型，表达于肿瘤增殖区外周。
Rahadiani等研究发现培养的食管鳞癌podoplanin阳性细胞传代可产生podoplanin阳性细胞和podoplanin阴性细胞，而podoplanin阴性细胞传代却只能产生极少量细胞。为了评估podoplanin在肿瘤发生中的作用，他们采用基因敲除技术阻断podoplanin在podoplanin阳性的ESCC细胞株KYSE-70和TnT中的表达，ESCC细胞出现化疗药物耐受性下降、侵袭性明显降低及成瘤能力显著低下等变化，但细胞增殖能力并没有受到影响。而通过对Podoplanin阴性的ESCC细胞株TE-1基因转染过表达podoplanin，则细胞出现耐药性、侵袭性及成瘤能力显著提高等变化。Naho等利用皮肤SCC细胞系A43l得出相似结论，同时他们发现podoplanin(+)的A细胞与正常鳞状上皮干细胞有共同的音猬因子(sonichedgehog,SHH)和CD44表达。
为明确podoplanin与ESCC淋巴结转移、肿瘤细胞及患者预后间关系，Rahadiani等发现podoplanin的表达与T分期(p=0.)、疾病阶段(p=0.)、淋巴管浸润(p=0.)、血管浸润(p=0.)、肿瘤复发(p=0.)有关，低表达podoplanin与高表达者相比拥有更好的OS(p=0.)和DFS(p=0.)。Tong等对56名术前未经过任何化疗或者放疗的患者进行一项回顾性研究发现podoplanin的表达与淋巴结转移(45%vs.19%,p=0.)、病理分期(60%vs.25%,p=0.)、患者的无病生存时间显著相关，高表达患者的5年无病生存率(5%)显著低于中度及低表达(27%,54%)患者(p0.)。Chao等对例患者研究发现，高表达podoplanin的患者与低表达podoplanin的患者相比DSS(5年DSS40%vs.10%,p0.)和DFS较短。
podoplanin表达可作为患者的淋巴结转移、预后的预测因子，可能是ESCC肿瘤干细胞标志物之一，可与其他标志物联合运用来分离食管鳞癌肿瘤干细胞。同时podoplanin可作为一个新治疗靶标，用于预防食管鳞癌的侵袭转移及其他恶性生物学行为。
ABCG2
三磷酸腺苷(ATP)结合转运蛋白G超家族成员2(ATP-Bindingcassettetransporter2，ABCG2)属ABC转运蛋白家族成员之一，定位于细胞膜，在正常组织中分布广泛，主要分布于具有分泌和排泄功能的组织如小肠、结肠上皮等，且各来源干细胞中ABCG2均高表达，是干细胞标记之一。
正常食管上皮ABCG2表达率约33-50%，而ESCC组织ABCG2表达率约70%，且ABCG2阳性细胞比例是可变的（0-％）。ABCG2主要位于正常食管上皮组织棘细胞层，为连续性，胞膜着色为主；在癌组织中，ABCG2多为巢团状分布，主要定位于癌细胞增值活跃区域，癌组织血管内皮见ABCG2表达[28]。多形性胶质细胞瘤ABCG2阳性癌细胞较ABCG2阴性癌细胞增殖速度和侵袭能力均明显上调。
ABCG2参与肿瘤多药耐药，主要通过主动转运功能将化疗药泵出胞外，推测ABCG2是CSCs耐药相关标志物。侧群细胞是从不同肿瘤和肿瘤细胞株中选取出来具较高克隆形成能力和在免疫缺陷小鼠高致瘤性，是确定及识别CSCs常见方法。鳞状上皮癌细胞(squamouscellcarcinomas，SCCs)中存在类干细胞侧群细胞(stemcell—likesidepopulation，SP)具有排除Hoechst能力，纯化后SCC-SP体外培养具无限增殖能力和动物体内强致瘤性，添加ABC转运体抑制剂时，SCC-SP对化疗药物表现出敏感性。
ESCC组织ABCG2表达高低与患者中位生存期有关，阴性患者比阳性患者中位生存期多得多（49.3mvs21.8m），复发率则较低表达ABCG2者要高[32]。此外，ABCG2表达还可能与淋巴结转移有关[31]，与肿瘤分化程度、浸润深度关系不确切[27,28,32]。
因此，ABCG2可能是ESCC的CSCs标志，并与ESCC不良预后及化疗耐药的不良生物学效应相关联。
ALDH1
乙醛脱氢酶1(aldehydedehydrogenase1，ALDH1)是乙醛脱氢酶家族成员之一，将醛类氧化为乙酸，将视*醇氧化为视*酸。人类ALDH1基因表达存在于细胞质中，其基因克隆和定位在9q21染色体，相对分子质量为54.86kD。ALDH1在干细胞中表达增高，在维持干细胞特性和干细胞分化中起重要作用，保护干细胞免受外源性或内源性药物或*物伤害。
ALDH1阳性肿瘤的化疗耐药性可能与ALDH1解*作用相关，ALDHI能氧化烷化剂环磷酰胺(CTX)的中间代谢产物醛磷酰胺，形成无*的羧基磷酰胺，而发挥对CTX解*作用，致肿瘤对CTX耐药。报道显示乳腺癌、结肠癌及头颈部鳞癌ALDH1阳性细胞具肿瘤干细胞特性。国内有实验室采用梯度增加剂量照射法建立了具有干细胞特性食管癌细胞株KYSER，并采用基因芯片技术检测到KYSE-R细胞中ALDH1各亚型均表达上调，其中以ALDH1A3的升高最显著。Wang等第一次报道食管鳞癌ALDH1表达情况，79例ESCC中的12例（15.2%）ALDH1阳性，与淋巴结转移和预后关系：相比于ALDH1阴性者，ALDH1者病理分化差（P=0.），淋巴结转移率高（P=0.），5年总生存率差(8.3%vs.52.2%,P=0.)。MinatoT等回顾分析例ESCC患者，56例直接接受手术，40例接受新辅助化疗后手术，56例患者接受化疗。结果发现，ALDH1阳性是直接手术（RFS，p=0.；CSS，p=0.）和新辅助化疗（RFS，p=0.；CSS，p=0.）者不良预后预测因子，但不能预测化疗（PFS，p=0.；CSS，p=0.）敏感性。因此，ALDH1也可能是ESCC的CSCs标志，与ESCC化疗耐药相关联，还可能与转移等不良临床转归有关。CD分子
CD是一种跨膜糖蛋白，是脑胶质瘤[39,40]、肝癌等的CSCs标志物。郑等用免疫荧光/免疫酶染色检测ESCC细胞系，发现Eca-和EC中CD或MDR1阳性率达70～80％，强阳性细胞一致率40％，二者表达强弱程度相符，说明CD强阳性细胞其多药耐药性也高，提示CD与ESCC的CSCs联系密切。鉴于学者认为形成细胞球的小CD阳性表达细胞是胶质瘤肿瘤干细胞的观点，郑等分别检测ESCC组织和细胞学标本CD强阳性小细胞表达，结果小CD阳性表达细胞占癌细胞8％，癌组织中约4％，主要位于鳞癌上皮基底层、癌珠周缘或癌灶内；ESCC细胞CD高表达和ESCC组织CD阳性细胞特殊定位，直观揭示CD阳性细胞具克隆形成潜能。存在相反研究结论，Hang等发现ESCC中CD表达与肿瘤细胞分化有关，与低分化ESCC相比，高分化ESCC过表达CD，但与总生存期关系不大。
CD44是一种多功能的跨膜糖蛋白，据外显子不同分为CD44S和CD44V，参与细胞粘附、运动、增殖、耐药性。CD44v6为上皮间叶细胞转化标志物，主要在具有转移能力的肿瘤细胞中表达，参与肿瘤细胞与宿主细胞、肿瘤细胞与宿主基质的粘附，并可提高肿瘤细胞的转移能力。Shen等研究发现，与邻近组织相比，其在ESCC组织表达明显增高，并与肿瘤分化、远处转移、TNM分期有关。LeBrasGF等发现ESCC的CD44上调与E-Cadherin丢失有关，促MMP介导肿瘤浸润。Zhao等[48]检测ESCC原代细胞系的实体肿瘤干细胞标志物CD44,CD90,CD,CD和CD表达状态，发现仅有高表达CD44的ESCC细胞具高的成瘤性和耐药性。郑等检测ESCC组织与细胞系CD44表达，强阳性细胞占40％，包含2个亚群：少数较小CD44阳性细胞亚群定位于鳞癌上皮基底层、癌珠周缘或癌灶内；较大CD44强阳性细胞亚群主要定位于鳞癌上皮棘细胞层及癌灶中。据此推测，CD44可能为ESCC的CSCs标志物。
CD属免疫球蛋白基因超家族成员，广泛参与多种组织细胞生长发育、参与肿瘤发生发展，调节MMP-2级联反应而影响肿瘤侵袭。一项42例ESCC回顾性研究，CD表达与年龄(60岁为界，80.1%vs71.8%，p=0.)、性别（75%vs80%，p=0.）等无关，与肿瘤分化程度相关：60%（高分化）vs90%（中低分化）（p=0.）。在侵袭程度较深（88.9%）以及有淋巴结转移（89.7%）患者中，CD表达阳性率明显高于侵袭较浅（53.3%，p=0.）和无淋巴结转移（46.2%，p=0.）患者，其表达可提示预后欠佳[49]。目前还没有关于CD作为食管鳞癌干细胞标志物的研究。
AkihikoSano等首次报道CD24的ESCC表达，他们免疫组化分析例ESCC标本，CD24阳性率40.4%(61/)，高于癌旁组织，在胞膜和胞质中均有表达。与ki-67表达（43/70vs18/81，p0.）、病理分期（9/42vs52/，p=0.）、淋巴结转移(43/85vs18/66，p=0.)、血管侵犯（49/89vs12/62，p0.）、无病生存时间(p0.)有关，多因素回归分析结果提示为独立预后因素(p=0.)。CD29即ITGB1，有研究称其表达与ESCC细胞多西他赛耐药显著相关，推测过表达可能与化疗耐药有关。
干细胞转录调控因子
OCT-3/4、SOX2、Nanog都属于干细胞转录调控因子，调节胚胎及组织的发育，参与胚胎干细胞和原始细胞的自我更新，是维持生命全能性所必须的转录因子，被认为是干细胞标志物[52]，但它们在分化或成熟的组织中其表达降低或消失。肿瘤干细胞与干细胞在细胞表型和生物学特性上有很多相似之处，越来越多研究证明，OCT-2/3/4、SOX2、Nanog在肿瘤组织也有表达，可能为CSCs标志物。
年Chambers等和Mit-sui等几乎同时在囊胚内细胞群(innercellNlaSS，ICM)、原始生殖细胞及胚胎干细胞发现一种新转录因子并命名Nanog。最近研究发现精原细胞癌、乳腺癌、神经胶质瘤等肿瘤细胞也表达Nanog。Du等发现，和周围正常组织相比，ESCC组织过表达Nanog的mRNA和蛋白，并与TNM分期和病理组织学分化、淋巴结转移相关。用siRNA降低ESCC细胞系TE-1、Eca中Nanog表达，可增强化疗药敏感性。Li等在ESCC细胞系EC得到同样结果。不过，Li等认为Nanog既在肿瘤干细胞中表达也在肿瘤细胞中表达，Nanog表达和肿瘤干细胞关系尚无定论。鉴于肿瘤细胞与胚胎干细胞均有无限增殖及保持低分化状态的特征，提示Nanog可能是调节细胞全能性与自我更新的关键因子。
陈等应用原位杂交和免疫组化法检测正常食管黏膜组织及ESCC组织SOX2mRNA和蛋白，显示SOX2正常黏膜组织mRNA表达显著低于ESCC组织；SOX2蛋白表达与其mRNA表达一致。ESCC组织SOX2mRNA和蛋白表达与组织分化程度、浸润深度、TNM分期及淋巴结转移密切相关。Zhou等[59]自行培养原代细胞高表达OCT-2/3/4、SOX2、Nanog，Oct4表达于肿瘤干细胞球中一些细胞。Oct4表达于肿瘤干细胞球和继发性肿瘤中表明Oct4+细胞可起始细胞致肿瘤复发细胞可能是食管鳞癌干细胞样细胞。Wang等[4]已经发现Sox2和Oct4在ESCC中表达并影响癌细胞凋亡、致瘤能力和耐药性等。低分化ESCC细胞系均表达更高水平Oct3/4和Sox2。高Oct3/4和Sox2蛋白表达水平与ESCC高组织学分级和差生存相关。Oct3/4和Sox2在ESCC发生和肿瘤干细胞特性中作用值得进一步研究。
其它一些标志物
HIWI是PIWI在人类的同系物。PIWI是年在果蝇的生殖干细胞内被发现的。PIWI家族在进化过程中高度保守，且维持干细胞自我更新、增殖分化、配子发生发育和增殖，及RNAi和转录调控起重要作用，是调节干细胞和生殖细胞关键因子。He等首次报道了HIWI在ESCC中的表达情况及其与预后的关系，他们对例ESCC患着的临床研究发现，HIWI蛋白阳性表达率达89.5％(／)，胞质与胞核均阳性表达，且胞质HIWI的表达水平与分化程度（p=0.）、T分期（p=0.）、总生存期（p0.）相关，和年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小、淋巴转移、临床分期无关。胞核中HIWI的表达与临床病理特点无关。但胞核中的表达与总生存期无关。胞质高表达HIWI者与低表达着相比肿瘤相关死亡风险增加了2.倍。陈等[60]在另一项针对ESCC组织的研究中得出相似结论：食管癌上皮组织和正常食管上皮组织中的HIWI的阳性表达率分别为69.2%(92/)和6.7%(1/15)(p0.05)。食管癌组织中的HIWI表达与食管癌分化程度、临床分期有关(p0.05)。同时刘等在食管鳞癌细胞系Eca中发现HIWI高表达，降低HIWI的表达后能够减慢食管癌细胞的增殖速度，提示HIWI是ESCC干细胞可能的表面标志。
beta-cateninprotein在正常食管组织中包膜大于胞质，而在食管鳞癌标本中，在胞质与胞核中高表达，包膜上低表达]。β-cateninmRNA表达与病理分期、淋巴结转移及预后相关(P＜0.05)，但蛋白质水平并未显示相关。胞膜上β-catenin的表达的减少与可肿瘤的远处转移和不良预后有关[64]。
结语
CSCs在肿瘤发生发展中的作用不可忽视，与肿瘤浸润、复发、转移、耐药等不良生物学效应关系密切，彻底清除CSCs是根治恶性肿瘤的重要途径。如何识别和分离肿瘤干细胞，为提供临床高效的诊断和治疗分子靶点是摆在我们面前的艰巨任务，积极开展针ESCC的CSCs标志物靶向研究，将对ESCC临床诊疗进展产生重要意义。
（图片来自网络）
参考文献(略)
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