文
九思
导读：年Gross和他的同事提出了嵌合抗原受体（ChimericAntigenReceptor,CAR）的概念，他们将抗体的抗原结合区scFv与CD3-ζ链或FcεRIγ的胞内部分融合形成嵌合抗原受体。随着科学技术研究的持续推进，目前CAR-T疗法已经发展到了第四代，该疗法在血液肿瘤治疗领域高歌猛进的同时，高昂的治疗费用也成为热门议题。去年国内上市的两款CAR-T药物治疗费用分别为万元（奕凯达）和万元（倍诺达），接下来笔者将梳理CAR-T制备流程和成本构成，以窥探CAR-T治疗究竟贵在哪里。
CAR-T疗法：是指通过基因克隆技术对具有免疫球蛋白（Ig）的抗原结合区的T细胞受体进行基因改造，将带有特异性抗原识别结构及T细胞激活信号的遗传物质转入T细胞，使T细胞直接与肿瘤细胞表面的特异性抗原相结合而被激活。CAR识别肿瘤抗原后，激活T细胞的免疫通路，相关基因表达上调，分泌颗粒酶、穿孔素等物质直接介导肿瘤细胞溶解，同时分泌粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、干扰素-γ（IFNγ）等炎症因子，招募巨噬细胞等固有免疫细胞响应杀伤肿瘤组织，从而治疗癌症。
CAR分子结构：CAR主要由识别肿瘤特异性抗原的单链抗体（scFV）段、铰链区及跨膜段、共刺激分子结构域、CD3ζ结构域构成。通过将编码CAR的基因引入T细胞，从最初一代CAR-T细胞发展到目前的第四代CAR-T细胞经历了30年的发展时间。
图1CAR-T细胞结构演变
表1四代CAR-T细胞结构的发展
01CAR-T制备流程复杂，耗时较长
目前上市的CAR-T产品均为自体细胞来源，自体CAR-T制备首先将病人的白细胞（WBCs）通过血细胞去除法分离后洗涤获得。然后，T细胞被激活，转导CAR基因，扩增到一定数量后罐装和密封后用于治疗。CAR-T细胞制备主要包括以下步骤：
图2临床规模自体CAR-T细胞疗法的制备过程
（1）单采白细胞及细胞清洗
在CAR-T疗法中患者的白细胞需要先被从体内提取出来之后，对之加以改造使其表达CAR-T，而后再输回患者体内。由于白细胞重量异于其他血液成分，利用密度梯度离心法从患者（已上市产品）或健康志愿者（发展趋势）外周血中分离白细胞，常用的血液成分分离机包括：Trima、UVAR-XTS、COBESpectra，之后洗涤去除白细胞分离过程中添加的抗凝剂。
（2）富集T细胞并激活
生产CAR-T时所用的T细胞富集手段一般是单抗磁珠富集法，T细胞通过CD4/CD8特异性抗体或者表面标记偶联磁珠进行分离，然后加入CD3/CD28单克隆抗体磁珠或人工抗原提呈细胞等对细胞培养基中的T细胞进行激活，这其实是模拟正常身体环境中树状细胞对休眠T细胞的刺激，并使其迅速活化。因为仅有活化后的T细胞能够快速分裂，且T细胞仅在活化后方能针对某一特定抗原分泌大量抗体。
（3）基因传递/转染
这是制备CAR-T的关键，使用慢病毒/逆转录病毒载体或非病毒方法（电转DNA、转座子/转座子系统）将CAR转染到T细胞中，CAR基因是T细胞准确识别肿瘤细胞的“眼睛”，载体的导入效率影响着CAR-T产品的成本和质量。理想的载体应具有较高的基因转染效率，稳定性好，不引起机体免疫反应等特点，目前已开展的临床试验以病毒载体转导为主。
图3CAR基因的导入的主要方式
γ-逆转录病毒载体是第一个用于人类的基因转导系统，临床应用未发生与基因插入诱变相关的不良反应，它属于一种RNA病毒。首先需要通过将包装有CAR基因序列和LTR序列、gag和pol基因系列、env基因系列的三个质粒导入宿主细胞，通过宿主细胞的细胞器复制/转录出病毒蛋白和所需的基因序列，并包装成携带CAR基因的γ-逆转录病毒载体。载体和活化的T细胞膜融合后，释放CAR基因，沿着微管被运输到细胞核（得益于核膜被破坏），并整合进T细胞基因组之后进行转录表达得到CAR蛋白。
慢病毒载体相对γ-逆转录病毒转导质量更加，因而在临床上应用最多，但是由于二者为随机整合，仍然存在一定的安全风险；慢病毒载体具有更高的寄送效率和T细胞转导质量，慢病毒传染的CAR-T显示出更显著的抗肿瘤效力，是目前的主流递送载体，转染过程与逆转录病毒类似。可转导静止和活化的T细胞，转到效率接近%，转基因负荷量可达8kb，基因毒性更小，整合位点相比γ-逆转录病毒更安全但成本更高。
目前绝大多数CAR-T细胞CAR的转染都是基于病毒载体，但是病毒载体的制造过程复杂，成本昂贵且受到严格控制。监管上病毒载体在临床试验的早期阶段难以符合GMP（药物质量管理规范）的所有方面。因此，以转座子技术的非病毒基因传递是研发热点，转座子系统发生基因整合具有一定的靶向性，且成本低，有较大的潜力发展成为临床通用的T细胞基因转导系统。转座子基因载体由一个携带CAR（转座子）的质粒和一个携带转座子酶的质粒组成，质粒经电穿孔进入T细胞，转座酶被表达后作用于CAR侧翼的末端导致重复序列，导致在T细胞基因组的TA二核苷酸序列上进行切除和整合，插入CAR基因，转录表达后在细胞表面生成CAR。目前有基于SleepingBeauty(SB，“睡美人”)转座系统和基于PiggyBac(PB)的转座系统。
mRNA电穿孔是将CAR基因导入T细胞最简单和最安全的方法，但是mRNA的不稳定性要求进行多次的T细胞输注。
表2CAR基因转导方法对比
（4）细胞扩增培养
通过生物反应器等细胞培养设备对T细胞进行扩增培养。患者身上只能分离少量的淋巴细胞，大多数有白细胞减少症和其他并发症，需要将适宜的T淋巴细胞扩增以达到治疗目的。有许多患者最终无法接受CAR-T治疗，原因就在于这些患者的T细胞无法在体外充分扩增，未达到目标剂量。CAR-T细胞扩增需要一个封闭、自动化和受控的扩增平台。细胞培养可以通过不同的容器进行扩增，包括T瓶、平板或培养袋以及生物反应器。利用摇摆式生物反应器（例如WAVE）进行扩增是目前主要的培养方式，除此之外，自动化的细胞培养生产设备（例如CliniMACSProdigy）也能够产生大量的CAR-T，这种自动化的设备比起摇摆式生物反应器大大减少人为操作。
图4T细胞培养过程
（5）冷冻及运输，最终回输患者
根据配方调整细胞数和培养基成分，然后将产品转移到合适的容器中进行冷冻及运输，最终回输到患者。将复制扩增好的T细胞用静脉输液的方式输入患者体内，有效增加血液内杀伤性T细胞的数量，识别肿瘤细胞起到有效杀灭肿瘤细胞的目的。联合静脉输注+局部注射CAR-T细胞治疗复发性弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）结外病变，患者获得持久缓解，无严重不良反应，静脉输液+局部注射可能成为部分患者更优回输途径。
02CAR-T细胞复杂的制备工艺带来高昂成本
CAR-T细胞规模生产中的影响因素
根据已披露的临床试验，CAR-T疗法从白细胞采集到回输的时间大多在10-25天左右，获取并激活T细胞耗时1天，载体转染耗时2天，扩大培养耗时7天左右，制备及质控耗时3天左右。其中Kymriah制备耗时为22天，Yescarta为17天。虽然目前的细胞疗法开发过程中基本方案类似，但是工业界还没有开发出一个成熟的，完全可被接受的CAR-T生产工艺，许多CAR-T产品使用人工操作，非常耗时耗力，而且难以扩大，失败率高。整个CAR-T制备工艺非常复杂，而相对应的其生产工艺过程的优化却较为缓慢。
如前所述，相当大的可变因素可能会阻碍CAR-T细胞的制造，CAR-T细胞制造中变异的主要来源——
（A）操作变异(方法、人员、设备)：这主要是操作员/操作设备变化的结果，特别是在使用手动式处理系统时，完全自动化的制造程序可以将操作变异带来的影响降至最低；
（B）原材料和试剂（血清、培养基、生长因子等）：用于更好实现细胞扩增的培养基和试剂（例如细胞生长因子）目前尚未标准化，原材料和试剂如果根据GMP规范制造可能难以获得；
（C）环境变量（温度、粒子数、气体张力、湿度）：在CAR-T细胞制造过程中应监测环境参数以确保制造过程一致性，确保产品质量和无菌性，在理论上这些方面可以通过功能封闭的系统实现；
（D）生物因素（起始材料质量和组成）：这是最重要的因素。生物因素是CAR-T细胞制造中不可避免的变量，其中最重要的可变性包括：细胞活力、T细胞含量、健康状况和表型。
另外不同患者的辅助细胞也会有很大的差异，例如巨噬细胞和单核细胞。但是细胞治疗产品质量控制的安全性、纯度、效力以及均一性会贯穿CAR-T生产的各个阶段，这也增加了CAR-T治疗的成本。
图5CAR-T细胞规模生产中的变量
CAR-T细胞制备的成本构成，耗材占用总成本的一半
Kymriah在美国定价为47.5万美元/针，Yescarta在美国定价为37.3万美元/针，在中国上市的奕凯达和倍诺达的价格为万元/针和万元/针。CAR-T价格高昂主要是由针对患者的个性化定制带来的极高生产成本导致。
根据发表在《internationaljournalofcancer》的文献报道，生产单人份CAR-T细胞成本约为8万美元。在CAR-T的整个生产流程中，占用成本最多的是培养及转导CAR-T所用的培养液、质粒、核酶、病毒载体等耗材，占用了成本的约49~51%，具体金额在5万美元/针左右。CAR-T的生产与化学成分生产与控制（CMC）水平相关，以激活所使用的CD3/CD28beads为例，一管约在8万元，制备一份CAR-T细胞需使用1/4~1/3，若CMC要求高，则剩余的beads都不能再使用，这也将造成成本的增加。所用病毒载体的GMP生产约占总成本的30%，当对病毒载体的需求量增大时，可降低CAR-T细胞制备的生产成本，以葛兰素史克的慢病毒载体生产为例，生产剂CAR-T慢病毒载体时，成本约为2.5万美元/剂，生产0剂时，成本约为美元/剂；生产00剂时，成本约为美元/剂。其次是质控过程测量CAR-T产品无菌水平、细胞存活、CAR表达水平等所需的耗材，占用总成本的24~25%，具体金额约为2.5万美元/针。目前影响CAR-T生产成本最大的两项因素是产能利用率和病毒载体，提升生产规模和降低基因转导载体的成本是降低CAR-T成本最有效的方式。
图6CAR-T生产成本分析（Kymriah为例）
总之：CAR-T治疗复杂的工艺以及针对患者的个性化定制是导致成本高昂的主要原因，限制了产品临床试验的推进和可及性。但是CAR-T细胞疗法治疗在临床应用的开展至今不过短短十几年时间，随着CAR-T细胞结构的逐步改进和完善，开发同种异体CAR-T已经成为该疗法下一步的发展方向。通用型CAR-T(UCAR-T)可实现生产流程的规模化和标准化，可将生产成本降低90%，也期待着CAR-T治疗成本降低来惠及更多患者。
资料来源：
（1）Chimericantigenreceptor-Tcelltherapymanufacturing:modellingtheeffectofoffshoreproductiononaggregatecostofgoods.
（2）StructuralevolutionandprospectofchimericantigenreceptorTcell(CAR-Tcell).
（3）ScalableManufacturingofCARTCellsforCancerImmunotherapy.
（4）兴业证券