淋巴瘤的诊断难度较大，往往需要综合血液病理学（包括组织和细胞形态学、免疫表型、遗传学和分子生物学）与临床特征才能做出精确诊断，但流式细胞术（FCM）免疫分型作为与免疫组织化学相补的诊断方法，以其快速、客观、定量及多参数分析等独特优势，在淋巴瘤诊断方面也发挥着不可替代的作用。
为了帮助大家更好的了解流式检测技术在成熟T淋巴细胞肿瘤，尤其是在T/NK细胞淋巴瘤诊疗中的应用，高博流式创新研究院系列课程再次邀请上海交通大医院翁香琴教授，为我们分享《流式细胞术诊断成熟T淋巴细胞肿瘤》这一讲的精彩内容。
FCM在非霍奇金淋巴瘤（NHL）诊断中的作用
FCM在NHL诊断中的作用主要分为三个方面：确定诊断、辅助诊断和微小残留病（MRD）检测。
01可以明确NHL诊断
主要见于具有特征表型并常以白血病形式存在的淋巴瘤类型，如急性淋巴细胞白血病/淋巴母细胞淋巴瘤（ALL/LBL）、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤（CLL/SLL）、毛细胞白血病（HCL）、浆细胞肿瘤（PCN）、T大颗粒淋巴细胞白血病（T-LGLL）、NK细胞-慢性淋巴增殖性疾病（NK-CLPD）、成人T细胞白血病/淋巴瘤（ATLL）、肝脾T细胞淋巴瘤（HSTL）、Sezary综合征等。
02作为NHL辅助诊断
主要是指免疫表型不具有特异性，或具有特定遗传学异常的淋巴瘤类型，FCM可以作为形态学、遗传学的重要补充，起到辅助诊断的作用。
常见的有：边缘区淋巴瘤（MZL）、滤泡淋巴瘤（FL）、幼淋巴细胞白血病（PLL）、套细胞淋巴瘤（MCL）、淋巴浆细胞淋巴瘤/华氏巨球蛋白血症（LPL/WM）、Burkitt淋巴瘤（BL）、非特指型外周T细胞淋巴瘤（PTCL，NOS）血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤（AITL）、弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）等。
03MRD监测
对于成熟淋巴细胞肿瘤来说，较为成熟的FCM-MRD检测方案主要集中在B细胞类型上，检测灵敏度可以达到10-4~10-5。
而T/NK细胞淋巴瘤的肿瘤细胞免疫表型与正常T/NK细胞重叠性较大，导致识别肿瘤细胞的灵敏度不高，FCM对T/NK细胞淋巴瘤的MRD检测尚不成熟。
成熟T细胞肿瘤
我们在分析成熟T细胞肿瘤异常免疫表型之前，首先需要了解正常成熟T细胞的免疫表型特点。
01正常成熟T细胞的免疫表型
T细胞占外周血淋巴细胞的60%～70%，在胸腺中分化发育，成熟过程中CD34、TdT、CD99和CD1a等抗原消失，出现T细胞受体（TCR）基因重排，并最终与膜CD3形成复合物。
αβ和γδT细胞在胸腺发育早期出现分化，静息状态下，绝大多数（95%）循环中的T细胞为TCRαβ型。γδT细胞主要分布在脾脏红髓、呼吸道和肠道的黏膜和皮下组织内。
正常外周血CD4/CD8比值约为2∶1，骨髓中则相反，约为1∶2，正常成熟T细胞表达CD2、CD3、CD5和CD7，表达CD4或CD8，在外周血中CD4、CD8双阳性和CD4、CD8双阴性细胞比例较低。
此外，正常成熟T细胞CD45RA/CD45RO呈现异质性表达模式。最重要的是，正常T细胞呈非克隆性增殖。
02成熟T细胞肿瘤的异常免疫表型
肿瘤细胞最大的特点克隆性增生，即丧失异质性，成熟T细胞肿瘤的异常免疫表型主要表现为以下几个方面：
①抗原表达强度的改变：1个或以上的泛T细胞抗原表达强度改变，CD3、CD5、CD7表达异常较为常见，CD2则较少见；
②T细胞群体中某些抗原表达异常升高：如CD16、CD56、CD57、CD25、HLA-DR、CD等；
③伴有异常抗原表达：如CD13、CD33、CD10、CD20、CD30、CD等；
④CD4/CD8比例失衡：大于10:1或小于1:10；病毒感染时可见CD4-CD8+T细胞的大量扩增，注意鉴别；
⑤CD4+CD8+或CD4-CD8-细胞群比例升高；
⑥TCRα/β+细胞呈克隆性增生，TCRγ/δ+T淋巴细胞表达TCRVδ1为主。
03T细胞克隆性检测
①T细胞克隆性鉴定的价值
优点：敏感性较高，几乎所有肿瘤性T细胞都克隆性增生。
缺点：肿瘤特异性不如B/浆细胞中的κ、λ轻链；存在假阳性，某些反应性T细胞也可出现克隆性增殖；存在假阴性，大量正常T细胞中包含少量肿瘤细胞时易漏检（设门抗体的选择至关重要）。
②TCRα/β+细胞的克隆性鉴定
对于α/β+T细胞来说，克隆性鉴定的方法分为两类：
检测T细胞受体β链可变区（TCRvβ）的24种抗原表位。正常T细胞分散表达24种TCRvβ抗原，总和约70%。当出现其中1种TCRvβ抗原的显著增高或者24种表位总和的显著减低时，均提示T细胞的克隆性增生（图1-图4）。
检测T细胞受体β链恒定区抗原（Tcellreceptorbetachainconstantregion，TRBC)。正常T细胞部分表达TRBC1，部分表达TRBC2，只表达TRBC1或TRBC2可提示T细胞的克隆性增生（图5-图6）。目前商品化有售的只有TRBC1，TRBC1阳性率大于85%或小于15%可作为克隆性证据。
翁教授指出，TRBC方法只需要检测两种抗原，比TCRvβ简便许多，但其鉴定T细胞克隆性的准确性与TRCVβ检测结果是否可比，还有待更多的数据验证。
图1TCRvβ系列抗原检测——正常TCRα/β+细胞分散表达24种TCRvβ抗原
(TotalTCRVβ70.9%，符合正常T细胞的多克隆性增生)
图2TCRvβ系列抗原检测——反应性TCRα/β+细胞
(TotalTCRVβ88.9%，其中TCRVβ7.1占30.6%，符合寡克隆性增生)
图3TCRvβ系列抗原检测——TCRα/β+细胞克隆性增生
(TCRvβ13.1约占86.4％，提示T细胞呈克隆性增生)
图4TCRvβ系列抗原检测——TCRα/β+细胞克隆性增生
(TotalTCRVβ5.4%，间接提示存在其它的TCRVβ克隆)
图5TRBC系列抗原检测——反应性T细胞非克隆性增生
图6TRBC系列抗原检测——TCRα/β+细胞克隆性增生
(TRBC1表达85%或15%，提示T细胞克隆性增生)
③TCRγ/δ+细胞的克隆性鉴定
对TCRγ/δ+细胞的克隆性鉴定相对较难。正常成人γ/δ+T细胞表达TCRVδ2为主（胚胎期T细胞表达TCRVδ1为主），γ/δ+T细胞高表达TCRVδ1可提示克隆性。
成熟NK细胞肿瘤
01正常成熟NK细胞的免疫表型
正常NK细胞表达CD2和CD7，部分表达CD8，不表达sCD3、CD4和TCR，多数情况下不表达CD5（部分NK细胞亚群表达CD5），NK细胞特征性地表达CD16、CD56、CD94、CD和颗粒酶B（granzymeB），或多或少表达CD57，均一性表达CD45RA，KIR系列抗原表达呈现多克隆性分布。
外周血中存在两个NK细胞亚群，绝大多数为CD56dimCD16＋NK细胞，杀伤活性较强，少数为CD56stCD16dim/－NK细胞，主要功能是分泌细胞因子。
02成熟NK细胞肿瘤的异常免疫表型
成熟NK细胞肿瘤的异常免疫表型可以表现为NK细胞标志物（CD16、CD56、CD57和CD94等）的异常表达，也可出现CD2和/或CD7表达减弱或缺失，少数病例可获得CD5的表达。
侵袭性NK细胞（图7）与EB病毒感染高度相关，白血病表型多为CD3－CD16－CD56st，而NK-CLPD的细胞（图8）表型为CD3－CD56dimCD16＋，表型更为成熟。
图7侵袭性NK细胞白血病示例
（CD3-CD2+CD7-CD56stCD16dimCD94+CD57-CD45RA+CD45RO+，
FS/SS均大于正常NK细胞）
图8NK-CLPD示例
（CD3-CD56dimCD16stCD94+CD57+CD45RA+CD45RO-，FS/SS同正常NK细胞）
FCM检测在T/NK细胞淋巴瘤诊断中的应用
01T/NK细胞淋巴瘤的FCM诊断流程（图9）
图9常见T/NK细胞淋巴瘤的典型免疫表型鉴别诊断流程图
02T/NK细胞淋巴瘤免疫分型的抗体选择
为了尽可能地优化抗体和样本用量及对不同亚型淋巴瘤的精确诊断，临床检测中通常采用两步法：先应用一线抗体确定肿瘤属性和系别，随后应用二线抗体进行精准分型。
T/NK系一线初筛抗体包括CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD45和CD56。确定为肿瘤细胞及其系别来源以后，进行第二步全面精细检测。
二线抗体有：cCD3、CD10、CD16、CD57、CD25、CD26、CD30、CD45RA、CD45RO、TCRαβ、TCRγδ和cTIA-1等。
随后，翁教授结合病例讲述了成熟T细胞肿瘤数据的具体分析思路（图10~图17）。
图10成熟T细胞肿瘤数据分析思路示例
图11MF/SS示例
（CD3+CD7-，CD4+CD8-，CD26-，FS/SS较小，多数不表达NK相关标记）
图12AITL示例
[CD3-CD4+CD8-CD5+CD2+CD7dim/-（最常见）]
图13T-PLL示例
（CD3+CD4+CD8+，CD7stCD5st，CD52st，FS或略大，多数不表达NK标记。
T-PLL中约60%CD4+CD8-，25%CD4+CD8+；强表达CD52，表达cyTcl1）
图14ALCL示例
（CD30+CD2+CD5-CD7-CD4-CD8-CD3-，FSC较大，“nullphenotype”）
图15TCRα/β+T-LGL示例
（CD3+CD8-CD4-CD5dim/-CD57+CD16+,TCRγ/δ+,TCRVδ1+）
图16HSTCL示例
（CD3+CD2+CD7+CD5-CD4-CD8-，CD16+CD57+CD56-TCRγ/δ+，FS、SS较大）
图17肝脾CD4-CD8-TCRαβ+T细胞淋巴瘤示例
（骨髓中可见到免疫表型异常的T淋巴细胞：FSC小、SSC低，CD7表达缺失，CD3表达略下调，CD4-CD8-，CD5+CD2+且表达强度未见异常，TCRαβ+TCRγ/δ-，CD45RO+CD45RA-，CD16-CD56-CD94-，CD57p+，CD45st；TCRVb3约占98.0%，提示T淋巴细胞克隆性增生）
最后，翁教授对本课程进行了小结。翁教授再次强调了掌握正常NK/T细胞抗原表达规律是免疫分型诊断NK/T细胞淋巴瘤的前提。异常NK/T淋巴细胞常见的免疫表型为NK/T细胞抗原表达量的异常和克隆性增生。
此外，翁教授还特别指出克隆性NK/T淋巴细胞增生并不等同于肿瘤，需要结合临床和随访进行综合诊断。
参考文献
[1]王慧君,吴雨洁,翁香琴,徐卫,邱录贵.流式细胞学在非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用专家共识[J].中华病理学杂志,,46(04):-.