Multipleximmunofluorescence
多重免疫荧光结合单细胞蛋白组技术探索肿瘤微环境
技术背景：解析组织原位蛋白表达谱信息，并在单细胞层面进行深入的全方位数据解读已经成为了肿瘤微环境研究的下一个热门领域。
早在十几年前，以MALDI-IMS质谱组织原位成像技术为代表的原位分析方法已经崭露头角，并被应用到肿瘤微环境研究中。虽然该技术可以在几十微米分辨率的基础上实现几十种到一百种蛋白或多肽片段的分析，然而该技术一般通过HE组织染色来指导需要解析的兴趣区域（RegionofinterestsROIs），并受制于其分辨率，因此很难对肿瘤微环境的热门区域，如肿瘤浸润淋巴细胞TIL，肿瘤相关巨噬细胞TAM以及三级淋巴结构TLS等微环境亚组织结构进行精确剖析。加之作为非偏倚的质谱蛋白组学技术，无法对肿瘤微环境中的特定兴趣靶点进行基于密度距离的精确定量分析，尤其在靶向药物免疫药物结合的研究中，不能发挥强大的作用。
最近多重离子束成像技术MultiplexedIonBeamImaging（MIBI）在一定程度上解决了这个问题，作为基于抗体免疫反应为基础的靶向捕获分析技术，MIBI可以实现原位检测多于40重靶点（商业化可用），并可实现单细胞甚至亚细胞结构上对蛋白进行定量。然而，极高的硬件造价和同位素标记抗体，特殊的组织固定基质以及可选择的同位素种类均限制了该技术的大规模应用。
基于传统的、高度可依赖的多重免疫荧光技术Multipleximmunofluorescence（MxIF）或通过寡核酸偶联荧光基团来实现蛋白原位捕获和定量分析的技术在近些年有了质的飞跃。随着数字病理和人工智能结合技术的发展，现代研究已将组织多重荧光标记的潜能发挥到了一个新高度，这也是基于蛋白表达谱的单细胞信息成功整合并实现多元化分析的一项重大突破。在多种新型蛋白组学和空间组学技术的基础上，非因生物拥有国内最先进的MxIF技术，协助研究者对肿瘤微环境进行更加深入的剖析。
技术亮点：相较于单靶标染色，多重标记成像对于肿瘤微环境的分析更加深入。从临床角度来看，同时检测多个生物标志物的空间分布对于患者分级和治疗的反应预测更加可靠，在结直肠癌的免疫评分（Immunoscore）中已经体现出强大的临床优势。从基础研究和转化医学角度，多重标记成像技术可以提高生物标志物开发效率，更加精准的筛选靶向药适用人群。
然而，多标记免疫荧光染色一直以来存在诸多困难，例如抗体种属交叉反应、多轮处理后的标签稳定性、背景信号，高低信号之间的平衡以及弱表达标记物的检测等。因而在FFPE组织或鲜冻切片中检测三种或更多生物标记物成为限制研究者的一大障碍。非因生物引进的MxIF技术很好的解决了这一难题，它可以在单个组织切片上同时研究多达50-60个以上的生物标志物。通过对组织样本进行高维度分析，研究人员可以探索肿瘤微环境中不同靶标之间的空间关系。该技术通过特殊的荧光擦除技术，背景自荧光矫正，并结合从高内涵成像技术转化而来的高精度连续成像技术对组织样本进行高精度扫描，同时结合HALO人工智能图像识别，对样本区域进行组织分类，定量和密度距离计算等其它基于单细胞研究的分析。
应用前景：MxIF成像平台可以应用于任何组织，该技术保留了常规分析中细胞分散时丢失的组织空间结构，为深入研究肿瘤微环境、开发生物标志物以及发现肿瘤异质性等方面提供了一个强有力的工具。在这里我们列举了两篇有代表性的文章，详细介绍了该技术在肿瘤微环境中免疫检查点的作用、以及在生物标志物和组织异质性研究中的强大应用潜力。
文章解读
案例一：
年6月EliotT.McKinley等人在JCIInsight杂志上(IF:6.)发表题为“Optimizedmultipleximmunofluorescencesingle-cellanalysisrevealstuftcellheterogeneity”的文章（如图1）。
图1
簇细胞（tuftcell）作为肠道上皮中的特殊小亚群，在感染II型免疫应答机制中发挥着重要作用，该类细胞的标志物，群内亚型，以及分布情况还在不断探索中。文中作者采用MxIF成像平台，以小鼠的肠道簇细胞（tuftcell）为研究样本，通过对19种蛋白标记进行原位共染色对簇细胞数量、分布和蛋白质表达谱进行全面分析。发现了两个新的肠道簇细胞标记蛋白Hopx和EGFR磷酸酪氨酸与DCLK1阳性细胞亚群的空间共定位。阐明了其异质性的存在，同时识别了小肠和结肠中肠道簇细胞表达的不同剖面，以及在无菌小鼠中引入共生菌群后结肠群体的变化。
研究者通过MxIF对正常小鼠肠道的分化细胞、祖细胞/干细胞的标志蛋白信号以及一组分割标记进行分析，发现在隐窝和绒毛DCLK1阳性亚群细胞中p-EGFR表达水平更高，特别是在肠道凸起顶部小管处（如图2）；Hopx染色显示在整个隐窝基底祖细胞/干细胞区以及簇细胞中表达，Hopx缺失的小鼠肠切片未染色证实了Hopx抗体的特异性（如图3）。通过t-SNE降维分析对单细胞表达数据进行可视化显示，发现一种具有高DCLK1染色强度的独特的簇状细胞区域，与先前数据符合，并验证了p-EGFR和Hopx高表达的亚群确实存在（如图4）。
图2小鼠小肠和结肠p-EGFR染色
图3小鼠组织中Hopx抗体的验证
图4小鼠小肠上皮细胞19种标记的t-SNE聚类分析
研究发现，小肠绒毛和隐窝内的肠道簇细胞以及祖细胞和干细胞都表达Sox9、Lgr5、Hopx和p-EGFR（如图5）；DCLK1阳性细胞从未用增殖标记物PCNA进行过增殖（如图6）；在稳态下，小肠中较高比例的DCLK1阳性簇细胞表达高水平的Cox2和Hopx。
图5小肠绒毛细胞标记物的表达
图6肠簇细胞不增殖
为了分析空腹和空服后又复食的小鼠小肠内簇细胞亚群的种群动态，研究者进一步用6种小管细胞标记物(DCLK1、Cox2、Sox9、Lgr5、Hopx和p-EGFR)在单细胞层面进行分析。发现禁食后小肠簇毛细胞比例显著增加，复食后仍保持较高水平；同时在比较小肠和结肠在体内平衡时，DCLK1/Cox2/Sox9/Lgr5/p-EGFR阳性在结肠中显著减少，而DCLK1/p-EGFR/Sox9显性表达显著增加。
研究者同时评估了微生物引入后结肠簇细胞表达谱的变化。与无菌小鼠相比，微生物导入1周后结肠中簇状细胞比例增加，但在引入微生物或无特异性病原体(SPF)小鼠8周后没有变化。
然后利用同样的方法来分析人肠簇细胞中p-EGFR的表达。Cox2和p-EGFR在人小肠和结肠中共定位(如图7A)，同时对p-EGFR和肌动蛋白在人十二指肠组织切片中进行染色成像（如图7B），发现除细胞核外，p-EGFR在整个细胞中均有表达，并在根尖表面高度集中。
图7p-EGFR在人肠簇细胞中的表达
这篇文章验证了MxIF技术在发现新的生物标志物和定义罕见的异质细胞群方面的强大作用；同时该技术可以用于研究任何组织，包括肿瘤和组织微环境、肿瘤免疫全景分析等。
案例二：
散型大B细胞淋巴瘤（DLBCL）作为恶性程度高的B细胞淋巴瘤，在免疫检查点抑制剂（PD-1/CTLA-4）的临床研究中还有很多难题待解决。二期临床的响应率也不容乐观，PD-L1/PD-1的表达虽然先前曾有一定研究，但还未找到适合的生物标志物来指导临床分层，尤其是在微环境的深入研究中，缺乏数据支持。ZijuYXu-Monette等人通过对大量DLBCL病人的13种marker进行免疫荧光定量全景分析，结合单细胞层面的细胞群距离数据，揭示了PD-1/CTLA-4免疫检查点的临床作用。在年2月发表了题为“ImmuneprofilingandquantitativeanalysisdeciphertheclinicalroleofimmunecheckpointexpressioninthetumorimmunemicroenvironmentofDLBCL”的文章（如图8）。
图8
该文章通过MxIL的免疫荧光技术，以例弥散型大B细胞淋巴瘤（DLBCL）新发病例为样本，对其13种免疫markers进行原位定量分析，并结合荧光原位杂交技术来研究PD-L1/PD-L2基因突变情况，将这两类数据与病人的生存和基因表达图谱数据相关联，来揭示DLBCL（细胞淋巴瘤）中免疫检查点在临床中的作用。
研究者通过多重荧光染色，对样本组织切片上免疫微环境中不同类型的细胞进行计数（细胞密度），发现缺乏T细胞和/或NK细胞浸润预示着较差的生存率。接着研究者对PD-1+,PD-L1+,PD-L2+,CTLA-4+不同类型的细胞进行占比分析，发现T细胞高表达PD-1与不良预后有关。而且ABC（活化的B细胞样）亚型相比GCB（生发中心B细胞样）亚型而言，在CD20+B细胞和CD68+巨噬细胞中PD-L1表达量更高，在CD20+B细胞中PD-1表达量更高（如图9）。在CD8+T细胞中PD-1+较高的百分比与全部的DLBCL细胞及CD8+T细胞亚群中较差的生存率有关（如图10）。
图9PD-1+,PD-L1+,PD-L2+,CTLA-4+在不同类型细胞中的表达有所差异
图10PD-1在不同类型的T细胞中的表达情况
与PD-1受体不同，CTLA-4的表达量非常低，主要是在细胞质中表达。T细胞内CTLA-4的表达与DLBCL更好的OS相关（如图11）。
图11CTLA-4+在T细胞中的表达与OS的关系
再通过对PD-L1+CD20+细胞到PD-1+CD4+T细胞或PD-1+CD8+T细胞之间的K-NearestNeighbor距离进行测量，发现在PD-1hi/CD8+T细胞的病人中，存在PD-L1—PD-1临近效应，DLBCL细胞中PD-L1+/PD-L2+高百分比与较好的预后有关（如图12）。
图12PD-L1与PD-1临近作用研究
通过荧光原位杂交FISH技术,作者研究PD-L1/PD-L2基因突变情况，发现PD-L1/PD-L2复制子未发生突变时预后较好。虽然在T细胞和NK细胞中PD-L1的表达与CD8+Tm细胞和巨噬细胞的浸润增加有关，但PD-L1在巨噬细胞、T细胞、NK细胞微环境中表达，显示DLBCL病人预后很差。根据细胞的密度分析，发现PD-1+CD8+T细胞、PD-L1+T细胞、PD-L1+巨噬细胞的高密度组与生存率差有关。
总结
多重免疫荧光（MxIF）作为一个逐步完善的空间组学新方法，已经可以实现在一张组织切片中进行超过50-60种蛋白的空间定性定量分析，为深入研究肿瘤微环境、开发生物标志物以及发现肿瘤异质性等方面提供了一个强有力的工具。